Third-generation sequencing


توالی یابی نسل سوم یک کلاس از روش های توالی یابی DNA می باشد که اخیرا تحت توسعه فعال قرار گرفته است. توالی یابی نسل سوم با خوانش توالی های نوکلئوتیدی در سطح یک مولکول عمل می کند، بر خلاف روش های موجود که نیازمند شکستن رشته های طویل DNA به قطعات کوچک و سپس ایجاد توالی های نوکلئوتیدی بوسیله تکثیر و سنتز هستند. چالش های جدی در مهندسی ابزارهای مولکولی لازم برای توالی یابی کل ژنوم وجود دارد تا این فناوری از نظر تجاری در دسترس باشد.
توالی یابی نسل دوم ، که اغلب به عنوان توالی یابی نسل بعدی خوانده می شود ، از زمان توسعه تاکنون بر فضای توالی یلبی DNA مسلط شده است. این روش به طرز چشمگیری هزینه  توالی یابی DNA را با یک رویکرد موازی گسترده که قادر به تولید تعداد زیادی خوانش با پوشش وسیع از کل ژنوم است، کاهش داده است.
از آنجا که ژنوم یوکاریوتی حاوی توالی های تکراری است، محدودیت عمده این کلاس از روش های توالی یابی طول خوانش های تولید شده است. به طور خلاصه، توالی یابی نسل دوم با تکثیر مولکول DNA و سپس انجام توالی یابی بواسطه سنتز انجام می شود. سیگنال فلورسنت جمعی ناشی از سنتز تعداد زیادی از رشته های DNA یکسان تکثیر شده، اجازه استنباط هویت نوکلئوتیدی را می دهد. با این حال، به دلیل خطاهای تصادفی ، سنتز DNA بین رشته های DNA تکثیر شده بطور پیشرونده ای همزمان نمی باشند. به سرعت، با افزایش طول خوانش، کیفیت سیگنال بدتر می شود. به منظور حفظ کیفیت خوانش، مولکول های طویل DNA باید به قطعات کوچک تقسیم شوند که این امر به محدودیت اساسی فناوری های توالی یابی نسل دوم منجر می شود. تلاش های محاسباتی با هدف غلبه بر این چالش اغلب به برآورد تقریبی تکیه دارد که ممکن است به مونتاژ دقیق توالی ها منجر نشود.
با قابلیت توالی یابی مستقیم مولکول های DNA منفرد ، فناوری های توالی یابی نسل سوم این توانایی را دارند که خوانش هایی به مراتب طویل تر از توالی یابی نسل دوم داشته باشند. چنین مزیتی هم برای علم ژنوم و هم به طور کلی در مورد زیست شناسی پیامدهای اساسی دارد. با این حال ، داده های توالی یابی نسل سوم میزان خطای بسیار بالاتری نسبت به فناوری های قبلی دارند ، که می تواند مونتاژ ژنوم پایین دست و تجزیه و تحلیل داده های حاصل را پیچیده کند. این فناوری ها بطور فعال در حال توسعه هستند و انتظار می رود میزان خطاهای آن ها کاهش یابد. برای برنامه های کاربردی که تحمل بیشتری نسبت به نرخ خطا دارند ، مانند فراخوانی واریانت ساختاری ، توالی یابی نسل سوم از روش های موجود بهتر عمل می کند.
فناوری های حاضر
فناوری های توالی یابی با رویکرد متفاوت نسبت به پلت فرم های نسل دوم برای اولین بار در سال 2008-2009 به عنوان "نسل سوم" معرفی شدند.
در حال حاضر چندین شركت در مرکز توسعه فناوری توالی یابی نسل سوم قرار دارند كه عبارتند از:  Pacific Biosciences، Oxford Nanopore Technology، Quantapore و Stratos. این شرکت ها برای توالی یابی مولکول های DNA منفرد رویکردهای کاملا متفاوتی دارند.
PacBio پلت فرم توالی یابی در زمان واقعی مولکول منفرد را بر اساس ویژگی های موجبرهای حالت صفر توسعه داد. سیگنال ها به شکل نور فلورسنت از هر نوکلئوتیدی که با DNA پلی مراز متصل به کف چاهک zL ترکیب شود، انتشار می یابند.
فناوری آکسفورد نانوپور شامل عبور یک مولکول DNA از ساختار منفذ با مقیاس نانو و سپس اندازه گیری تغییرات میدان الکتریکی اطراف منفذ می باشد؛ در حالی که Quantapore یک رویکرد اختصاصی نانوپور دارد. Stratos Genomics  با ورود پلی مری ، بازهای DNA را خارج می کند، "Xpandomers" ، برای غلبه سیگنال بر سر و صدای خوانش مولکول های تک رشته ای DNA  نانوپور استفاده می شود.
همچنین رویکرد فلورسانس مولکول منفرد شرکت Helicos ، قابل توجه است، اما این شرکت در پاییز سال 2015 ورشکسته شد.
مزایا
'خوانش های طویل تر'
مزیت بارز توالی یابی نسل سوم در مقایسه با نسل حاضر فناوری های توالی یابی، تولید خوانش های طویل تر می باشد. انتظار می رود که این طول خوانش طولانی تر ، چالش های محاسباتی متعددی پیرامون مونتاژ ژنوم ، بازسازی رونوشت و متاژنومیکس را در میان دیگر زمینه های مهم پزشکی و زیست شناسی مدرن کاهش دهد.
واضح است که ژنوم های یوکاریوتی از جمله پریمات ها و انسان ها پیچیده هستند و تعداد زیادی مناطق طویل تکراری دارند. خوانش های کوتاه از توالی یابی نسل دوم باید به استراتژی های تقریبی متوسل شوند تا بتواند توالی های طولانی را برای مونتاژ و فراخوانی واریانت های ژنتیکی بدست آورند. برای غلبه بر این محدودیت ها ، خوانش های دو طرفه توالی یابی نسل دوم اعمال شده است. با این حال ، طول دقیق قطعه دو طرفه خوانده شده اغلب ناشناخته است و لذا باید تخمین زده  شود. مزایای فناوری های توالی یابی نسل سوم با ممکن ساختن خوانش های طویل واضح می باشد. 
'اپی ژنتیک'
نشانگرهای اپی ژنتیکی تغییرات پایدار و بالقوه ارثی در مولکول DNA می باشند که در توالی آن نیستند. یک مثال متیلاسیون DNA در محل های CpG است که مشخص شده است بر بیان ژن تأثیر می گذارد. یک نمونه دیگر تغییرات هیستونی می باشد. نسل حاضر فناوری های توالی یابی برای تشخیص نشانگرهای اپی ژنتیکی به روش های آزمایشگاهی مانند توالی یابی ChIP متکی هستند. این روش ها شامل برچسب زدن به رشته DNA ، شکستن و فیلتر کردن قطعاتی است که حاوی نشانگر هستند و به دنبال آن توالی یابی. توالی یابی نسل سوم ممکن است به دلیل سیگنال متمایز از چهار باز دیگر نوکلئوتیدی ، شناسایی مستقیم این نشانگرها را ممکن سازد.
قایلیت حمل و سرعت
از دیگر مزایای مهم فناوری های توالی یابی نسل سوم می توان به قابلیت حمل و سرعت توالی یابی اشاره نمود. از آنجا که حداقل پردازش نمونه در مقایسه با توالی یابی نسل دوم مورد نیاز است، امکان طراحی تجهیزات در اندازه کوچک وجود دارد. اخیراً شرکت Oxford Nanopore Technology  دستگاه توالی یابی Minion را تجاری کرده است. این دستگاه توالی یابی تقریباً اندازه فلش مموری USB معمولی است و با اتصال به لپ تاپ به راحتی قابل استفاده است. علاوه بر این ، از آنجا که فرایند توالی یابی در مناطق ژنوم موازی نیست ، داده ها را می توان در زمان واقعی جمع آوری و تجزیه و تحلیل کرد. این مزایای توالی یابی نسل سوم ممکن است در بیمارستان که نیازمند جمع آوری و تجزیه و تحلیل سریع داده ها است، مناسب باشد.

Portability and speed

'چالش ها'↵توالی یابی نسل سوم ، همانطور که در حال حاضر مواجه است ، با چالش های مهمی که عمدتاً در شناسایی دقیق بازهای نوکلئوتیدی وجود دارد روبرو است. نرخ خطا در مقایسه با توالی نسل دوم هنوز بسیار بیشتر است. این امر به طور کلی به دلیل ناپایداری ماشین های مولکولی درگیر می باشد. به عنوان مثال ، در فناوری توالی یابی مولکولی منفرد و زمان واقعی PacBio ، مولکول DNA پلی مراز همانطور که روند توالی یابی انجام می شود، به طور فزاینده ای آسیب می بیند. علاوه بر این، از آنجا که این روند به سرعت اتفاق می افتد، ممکن است سیگنال هایی که توسط بازهای منفرد خاموش می شوند با سیگنال های بازهای همسایه محو شوند. این یک چالش محاسباتی جدید برای رمزگشایی سیگنال ها و در نتیجه استنباط توالی است. به عنوان مثال ، بدین منظور روش هایی مانند مدل های مارکوف پنهان با موفقیت هایی به کار گرفته شده است. به طور متوسط ، حدود 99.9٪ از ژن های افراد مختلف جمعیت انسانی مشترک می باشد. به عبارت دیگر ، تقریباً از هر هزار باز فقط یک باز بین دو فرد متفاوت است. نرخ خطای بالای ناشی از توالی یابی نسل سوم به منظور تعیین تفاوت های فردی بین اعضای یک گونه ، ناگزیر مشکل ساز است. ↵'مونتاژ ژنوم'مونتاژ ژنوم بازسازی توالی DNA کل ژنوم است. این به طور کلی با دو رویکرد کاملا متفاوت انجام می شود.'ردیف سازی مرجع'هنگامی که یک ژنوم مرجع در دسترس باشد، همانطور که در مورد انسان وجود دارد ، خوانش های توالی تازه می توانند به منظور تعیین خصوصیات آن با ژنوم مرجع ردیف شوند. چنین مونتاژ مبتنی بر مرجع سریع و آسان است اما عیب آن "پنهان کردن" توالی های جدید و واریانت های تعداد نسخه بزرگ می باشد. علاوه بر این ، ژنوم مرجع برای اکثر ارگانیسم ها هنوز وجود ندارند.مونتاژ از نومونتاژ از نو روش جایگزین مونتاژ ژنوم برای ردیف سازی مرجع است. این کاملاً به بازسازی توالی های کل ژنوم از خوانش های توالی خام بر می گردد. این روش زمانی انتخاب می شود که ژنوم مرجع وجود نداشته باشد، هنگامی که گونه ارگانیسم مورد نظر ناشناخته باشد مثل متاژنومیکس، یا هنگامی که واریانت های ژنتیکی مورد نظر با ردیف سازی ژنوم مرجع تشخیص داده نمی شوند.با توجه به خوانش های کوتاه تولید شده توسط نسل حاضر فناوری های توالی یابی، مونتاژ از نو یک مشکل بزرگ محاسباتی است. به طور معمول با یک روند تکرار شونده برای یافتن و اتصال خوانش های توالی با همپوشانی معقول خوانده می شود ، نزدیک می شوید. روش های مختلف محاسباتی و آماری مانند نمودارهای de bruijn و نمودارهای مورد توافق طرح همپوشان، برای حل این مشکل به کار گرفته شده است. با این وجود ، با توجه به ماهیت بسیار تکراری ژنوم یوکاریوتی ، بازسازی دقیق و کامل توالی ژنوم در مونتاژ از نو چالش برانگیز است. خوانش های دو طرفه به عنوان یک راه حل ممکن مطرح شده است ، اگرچه طول قطعه دقیقاً شناخته شده نیست و باید تقریبی محاسبه شود. ↵مونتاژ دو رگه - استفاده از خوانش های موجود در پلت فرم توالی یابی نسل سوم با خوانش های کوتاه پلت فرم نسل دوم - ممکن است برای رفع ابهامات در ژنوم هایی که قبلاً با استفاده از توالی یابی نسل دوم مونتاژ شده اند، استفاده شود. از خوانش های کوتاه نسل دوم نیز برای اصلاح خطاهایی که در خوانش های طویل نسل سوم وجود دارد، استفاده می گردد. 'مونتاژ دورگه'خوانش طویل که توسط توالی یابی نسل سوم ارائه شده است ، می تواند بسیاری از چالش های کنونی که مونتاژ ژنومی از نو با آن مواجه می شود را کاهش دهد. به عنوان مثال ، اگر کل یک منطقه تکراری بتواند به طور واضح در یک خوانش توالی یابی شود، هیچ نتیجه گیری محاسبه ای دیگری لازم نیست. روش های محاسباتی برای کاهش میزان خطای بالا پیشنهاد شده اند. به عنوان مثال، در یک مطالعه، نشان داده شد که مونتاژ از نو ژنوم میکروبی با استفاده از توالی یابی PacBio به تنهایی عملکرد برتری از توالی یابی نسل دوم دارد. توالی یایی نسل سوم ممکن است همچنین همراه با توالی یابی نسل دوم نیز استفاده شود. به این روش اغلب به عنوان توالی یابی دورگه اشاره می شود. به عنوان مثال، خوانش های طویل از توالی یابی نسل سوم ممکن است برای رفع ابهامات در ژنوم هایی که قبلاً با استفاده از توالی یابی نسل دوم مونتاژ شده اند ، استفاده گردد. از طرف دیگر، خوانش های توالی یابی نسل دوم کوتاه، برای اصلاح خطاهای موجود در خوانش های طویل نسل سوم استفاده شده است. به طور کلی، این رویکرد دورگه بطور قابل توجهی موجب بهبود مونتاژ ژنوم از نو می شود. ↵مارکرهای اپی ژنتیکی Big textمتیلاسیون DNA -تغییر کووالانسی DNA در محل های CpG که منجر به اتصال گروه های متیل می شود - بهترین جزء قابل درک ماشین اپی ژنتیک است. تغییرات DNA و بیان ژن ناشی از آن می تواند در انواع سلول ها متفاوت باشد. دوره تکوین ، با دودمان ژنتیکی ، به دلیل محرک های محیطی می تواند تغییر کند و قابل توارث هستند. محققان پس از کشف DNAm ، همبستگی آن را با بیماری هایی مانند سرطان و اوتیسم نیز پیدا کردند. در سبب شناسی این بیماری ها بستر DNAm یک راه مهم برای تحقیقات بیشتر است.مزایاBig textمتداول ترین روش های حاضر برای بررسی وضعیت متیلاسیون نیازمند سنجش قطعات DNA قبل از توالی یابی نسل دوم استاندارد، بر روی پلت فرم Illumina می باشد. در نتیجه خوانش کوتاه، اطلاعات مربوط به الگوهای طولانی تر متیلاسیون از بین می رود. فناوری های توالی یابی نسل سوم، قابلیت توالی یابی مولکول های منفرد در زمان واقعی را از خوانش های طویل تر و شناسایی تغییرات DNA بدون سنجش هایی که ذکر شد را ارائه می دهد. مونتاژ دو رگه - استفاده از خوانش های موجود در پلت فرم توالی یابی نسل سوم با خوانش های کوتاه پلت فرم نسل دوم - ممکن است برای رفع ابهامات در ژنوم هایی که قبلاً با استفاده از توالی یابی نسل دوم مونتاژ شده اند، استفاده شود. از خوانش های کوتاه نسل دوم نیز برای اصلاح خطاهایی که در خوانش های طویل نسل سوم وجود دارد، استفاده می گردد. دستگاه MinION شرکت Oxford Nanopore Technologgies برای تشخیص DNAm استفاه شده است. از آنجا که هر رشته DNA از یک منفذ عبور می کند، سیگنال های الکتریکی تولید می کند که مشخص شده به تغییرات اپی ژنتیکی موجود در نوکلئوتیدها حساس هستند و از یک مدل مارکوف پنهان برای تجزیه و تحلیل داده های MinION برای شناسایی تغییرات 5-متیل سیتوزین DNA استفاده شده است. اصلاح. این مدل با استفاده از DNA متیله شدهE. coli که بصورت مصنوعی سنتز شده و سیگنال های حاصل از آن که با استفاده از فناوری نانوپور اندازه گیری شده است، ارایه داده است. پس از آن، مدل برای تشخیص ۵- متیل سیتوزین در خوانش های ژنومیک MinION حاصل از یک رده سلولی انسانی که قبلاً یک متیلوم مرجع داشت، استفاده شد. طبقه بندی کننده دارای دقت 82٪ در محل های تک نمونه ای تصادفی است ، هنگامی که از حد آستانه های سخت گیرانه استفاده شود تا 95٪ افزایش می یابد. روش های دیگر، انواع مختلفی از تغییرات DNA را با استفاده از پلت فرم MinION ارائه می دهند. استویبر و همکاران 4-متیل سیتوزین و 6-متیل آدنین را به همراه ۵-متیل سیتوزین مورد بررسی قرار دادند ، و همچنین یک نرم افزار ایجاد کردند تا مستقیماً داده های خام MinION را به روش آسانی بصری کند. در اینجا آن ها دریافتند که در E. coli ، که دارای متیلوم شناخته شده است ، می توان از پنجره های رویداد به طول 5 جفت باز برای تقسیم و تجزیه و تحلیل آماری سیگنال های الکتریکی خام MinION استفاده نمود. یک آزمون ساده Mann-Whitney U test می تواند بخش های تغییر یافته از توالی E. coli را تشخیص دهد، و همچنین تغییرات را به مناطق 4mC، 6mA یا 5mC تقسیم کند. به نظر می رسد در آینده از داده های خام MinION برای تشخیص بسیاری از علائم گوناگون اپی ژنتیکی در DNA استفاده شود.برای تعیین متیلاسیون DNA از توالی یابی PacBio نیز استفاده شده است. در این پلت فرم گستره پالس - گستره یک پالس نور فلورسنت - به یک باز خاص مربوط می شود. در سال 2010 نشان داده شد که فاصله بینابینی در نمونه های شاهد و متیله شده متفاوت است و برای هر نوع متیلاسیون یک گستره پالس "منحصر به فرد" وجود دارد. در سال 2012 با استفاده از پلت فرم PacBio ، محل های اتصال DNA متیل ترانسفرازها مشخص شد. شناسایی متیلاسیون N6 در کرم C Elegans در سال 2015 نشان داده شد. متیلاسیون DNA روی N6-adenine با استفاده از پلت فرم PacBio در سلول های بنیادی جنینی موش در سال 2016 نشان داده شد. اشکال دیگری از تغییرات DNA -ناشی از فلزات سنگین ، اکسیداسیون یا آسیب با اشعه فرا بنفش - نیز راه های تحقیقاتی هستند که با استفاده از توالی یابی نسل سوم Oxford Nanopore و PacBio امکان پذیر می باشند.معایبBig textپردازش داده های خام - مانند نرمال سازی با سیگنال میانگین - بر روی داده های خام MinION نیاز بود و باعث کاهش توانایی در زمان واقعی فناوری می شد. پایداری سیگنال های الکتریکی هنوز یک معضل است و فراخوانی دقیق نوکلئوتید را دشوار می کند. MinION توان عملیاتی کمی دارد؛ از آنجا که خوانش های هم پوشان متعدد بسیار دشوار بدست می آیند ، این خوانش های بیشتر، منجر به رفع مشکلات شناسایی تغییرات پایین دست DNA می شود هم مدل مارکوف پنهان و هم روش های آماری که از داده های خام MinION استفاده نموده است نیازمند مشاهدات مکرر از تغییرات DNA برای تشخیص می باشد، به این معنی که نوکلئوتیدهای تغییر یافته منفرد باید به طور مداوم در چندین نسخه از ژنوم حضور داشته باشند، به عنوان مثال در چندین سلول یا پلاسمید موجود در نمونه.برای پلت فرم PacBio نیز بسته به نوع متیلاسیون دلخواه، نیازهای پوشش متفاوت است. از مارس 2017 ، سایر عوامل اپی ژنتیکی مانند تغییرات هیستونی با استفاده از فناوری های نسل سوم قابل کشف نیستند. الگوهای طویل متیلاسیون غالباً بعلت اینکه هنوز نیاز به مونتاژ کانتیگ های کوچکتر است، از بین می روند.ترانسکریپتومیکسBig textترانسکریپتومیکس به معنی مطالعه ترانسکریپتوم است ، معمولاً بعنوان فراوانی نسبی مولکول های mRNA بافت مورد مطالعه توصیف می شود. با توجه اصل بنیادین زیست شناسی مولکولی ، اطلاعات ژنتیکی از مولکول های DNA دو رشته ای به مولکول های mRNA تک رشته ای جریان می یابند جایی که می توانند به آسانی به مولکول های پروتئین عملکرد ی ترجمه شوند. با مطالعه ترانسکریپتوم ، می توانید درک ارزشمندی در تنظیم بیان ژن کسب کنید.در حالی که میزان بیان به عنوان میزان ژن می تواند کم و بیش به طور دقیق توسط توالی یابی نسل دوم به تصویر کشیده شود، اطلاعات میزان رونوشت هنوز یک چالش مهم است. در نتیجه ، نقش پیرایش متناوب در زیست شناسی مولکولی تا حد زیادی مبهم است. فناوری های توالی یابی نسل سوم با توالی یابی کامل مولکول های mRNA ، چشم انداز امیدوار کننده ای برای حل این مسئله دارند.'پیرایش متناوب'پیرایش متناوب فرآیندی است که با استفاده از آن یک ژن واحد می تواند چندین نسخه متمایز mRNA و در نتیجه ترجمه های پروتئینی متفاوتی ایجاد کند. برخی شواهد نشان می دهد که پیرایش متناوب یک پدیده همه جایی است و ممکن است نقش مهمی در تعیین فنوتیپ های موجودات زنده بویژه در یوکاریوت های پیچیده ایفا کند. همه یوکاریوت ها حاوی ژن هایی هستند که از اینترون ها تشکیل شده اند. به طور خاص، تخمین زده شده است که پیرایش متناوب در 95٪ از کل ژن های چند اگزون انسانی رخ می دهد. پیرایش متناوب پتانسیل غیرقابل انکاری بر بسیاری از روندهای زیستی دارد. پیشرفت دانش در این زمینه به طور کلی پیامدهای اساسی برای مطالعه زیست شناسی دارد.'بازسازی رونوشت'نسل حاضر فناوری های توالی یابی فقط خوانش های کوتاه را تولید می کند، که محدودیت فوق العاده ای در توانایی تشخیص رونوشت های مجزا ایجاد می کند. خوانش های کوتاه باید با مهندسی معکوس به رونوشت های اصلی تبدیل شوند که می تواند منجر به مشاهده خوانش ها گردد. این وظیفه توسط میزان بیان بسیار متغیر در رونوشت ها و در نتیجه پوشش متغیر خوانش توالی ژن پیچیدگی بیشتری می یابد. علاوه بر این، اگزون ها ممکن است در میان رونوشت های خاصی به اشتراک گذاشته شوند، لذا تفسیر واضح اساساً غیرممکن است. روش های محاسباتی موجود ، تفسیرها را بر اساس تجمع خوانش های کوتاه در توالی های مختلف اغلب با ساختن فرضیات ساده انجام می دهد. Cufflinks، یک رویکرد صرفه جویانه ای را در پیش می گیرد و در پی توضیح همه خوانش ها با کمترین تعداد ممکن از رونوشت ها است. از سوی دیگر ، StringTie تلاش می کند تا ضمن جمع آوری خوانش ها ، فراوانی رونوشت ها را هم برآورد کند. این روش ها، اگرچه منطقی هستند، همیشه رونوشت های واقعی را نمی توانند شناسایی کنند.مطالعه ای که در سال 2008 منتشر شد ، 25 پروتکل مختلف موجود در بازسازی رونوشت را مورد بررسی قرار داد. این شواهد نشان می دهد كه روش های موجود معمولاً در مونتاژ رونوشت ها ضعیف هستند، اگرچه توانایی تشخیص اگزون های منفرد را به طور نسبتاً بی عیبی دارند. طبق برآوردها ، میانگین حساسیت تشخیص اگزون ها در 25 پروتکل برای ژن های کرم Caenorhabditis elegans 80٪ است. در مقابل، حساسیت شناسایی رونوشت ها به 65٪ کاهش می یابد. بر اساس نتایج این مطالعه در انسان، میاگین حساسیت تشخیص اگزون 69٪ و میاگین حساسیت تشخیص رونوشت ها تنها 33٪ می باشد. به عبارت دیگر، برای انسان ، روش های موجود قادر به شناسایی کمتر از نیمی از کل رونوشت های موجود هستند.فناوری های توالی یابی نسل سوم چشم انداز امیدوار کننده ای در حل مسئله تشخیص رونوشت و همچنین برآورد فراوانی mRNA در سطح رونوشت ها نشان داده است. در حالی که نرخ خطا همچنان بالاست، فناوری های توالی یابی نسل سوم این توانایی را دارند که طول خوانش بسیار بیشتری داشته باشند. شرکت Pacific Bioscience پلت فرم iso-seq را معرفی کرده است و ادعا می کند که مولکول های mRNA را در طول کاملشان توالی یابی می کند. پیش بینی می شود شرکتOxford Nanopore فناوری های مشابهی را ارائه دهد. مشکلی که در نرخ خطای بالاتر وجود دارد ممکن است با خوانش های کوتاه با کیفیت بالا کاهش یابد. این روش قبلاً آزمایش شده و گزارش شده است که میزان خطا را بیش از 3 برابر کاهش می دهد. ↵ت با خوانش های کوتاه با کیفیت بالا کاهش یابد. این روش قبلاً آزمایش شده و گزارش شده است که میزان خطا را بیش از 3 برابر کاهش می دهد.
↵متاژنومیکس
متاژنومیکس آنالیز مواد ژنتیکی است که به طور مستقیم از نمونه های محیطی بازیابی می شود.
مزایا
مهمترین مزیت فناوری های توالی یابی نسل سوم در متاژنومیکس سرعت توالی یابی آن ها در مقایسه با روش های نسل دوم است. سرعت توالی یابی برای مثال در کلینیک از اهمیت زیادی برخوردار است ، تا امکان تشخیص کارآمد و اقدامات بالینی به موقع فراهم شود.
دستگاه Minion شرکت آکسفورد نانوپور در سال 2015 برای تشخیص متابوژنومیک در زمان واقعی پاتوژن ها در نمونه های بالینی پیچیده و با  پر خطر استفاده شد. اولین ویروس ابولا 44 ثانیه پس از جمع آوری داده ها توالی یابی شد. در اینجا نقشه خوانی یکنواخت برای خوانش های ژنوم وجود داشت. حداقل یک خوانش با بیش از 88٪ ژنوم نقشه برداری شده مطابقت داشت. خوانش های نسبتاً طویل، توالی یابی تقریباً کامل ژنوم ویروسی را با دقت بالا مستقیماً از یک نمونه بالینی اولیه امکان پذیر می سازد.
یک نشانگر فیلوژنتیک رایج برای مطالعات تنوع جامعه میکروبی ژن RNA ریبوزومی S 16 است. پلت فرم های SMRT Minion و PacBio برای توالی یابی این ژن استفاده شده اند. در این زمینه ، میزان خطای PacBio قابل مقایسه با خوانش های کوتاه تر 454 و پلت فرم دستگاه MiSeq شرکت Illumina است.
معایب
میزان خطای بالای MinION از شناسایی نشانگرهای مقاومت ضد میکروبی جلوگیری می کند، که بدین منظور تفکیک تک نوکلئوتیدی لازم است. به همین علت، پاتوژن های یوکاریوتی شناسایی نشده اند. همچنین سهولت انتقال آلودگی هنگام استفاده مجدد از flow cell   نگران کننده است. بارکدهای منحصر به فرد ممکن است امکان تعدد آزمایش را فراهم کنند. علاوه بر این ، انجام شناسایی دقیق گونه های باکتریایی ، قارچ و انگل ها بسیار دشوار است، زیرا آن ها بخش بیشتری از ژنوم را به اشتراک می گذارند، برخی از آنها تنها کمتر از 5٪ تفاوت دارند.   
هزینه توالی یابی هر باز هنوز هم به طور قابل توجهی بیشتر از MiSeq است. با این حال، چشم انداز تکمیل پایگاه های داده های مرجع با توالی های کامل از موجوداتی که زیر حد تشخیص رویکرد سانگر هستند؛ احتمالاً می تواند تا حد زیادی در شناسایی ارگانیسم ها در متاژنومیکس کمک کند.